El estudio de los mosquitos tiene una gran relevancia en varias disciplinas científicas –ya sean médicas, veterinaria o biológicas– debido al papel que desempeñan en la transmisión de numerosos patógenos transmitidos tanto a humanos como a animales (Beerntsen et al., 2010).

El comportamiento de alimentación de sangre de los mosquitos es complejo, determinando la tasa de contacto entre los huéspedes infectados y los susceptibles de ser infectados y, por tanto, su capacidad para transmitir dichos patógenos. Estas interacciones están impulsadas por factores relacionados con el huésped y el vector (Takken & Verhulst, 2013), el mosquito en nuestro caso. Éstos, al igual que otros insectos hematófagos, muestran preferencias por alimentarse de especies o individuos hospedantes particulares (Muñoz et al., 2012; Martínez-de la Puente et al., 2015), pero estas preferencias pueden, a su vez, estar parcialmente moduladas por factores relacionados con como la abundancia de huéspedes, su comportamiento defensivo contra los mosquitos u otros factores como la emisión de señales químicas (olor) o la temperatura del huésped (Takken & Verhulst, 2013). En conjunto, estos factores van a determinar la alimentación del vector y con ello el éxito de la transmisión de parásitos (Kilpatrick et al., 2006; Takken & Verhulst, 2013), ya que determinarán la frecuencia con la que entran en contacto el mosquito con el patógeno y por consiguiente la co-evolución mosquito-patógenos y la importancia de cada especie de mosquito como vector de patógenos.

Tras la ingesta de sangre, el desarrollo del ciclo de vida del patógeno dentro del mosquito puede diferir según el grupo de patógenos, lo que lleva a interacciones complejas con las células del intestino del mosquito. Los virus generalmente entran en contacto con las proteínas de la membrana de las células del intestino medio del mosquito (Hardy et al., 1983; Abraham & Jacobs-Lorena, 2004), mientras que los protozoos requieren el contacto inicial entre los gametos masculino y femenino para desarrollar cigotos antes de entrar en contacto con proteínas de la membrana de las células del intestino medio para completar su ciclo de vida (Valkiūnas, 2005). A pesar de estas diferencias, los patógenos suelen seguir los mismos pasos comunes; es decir, son ingeridos, expuestos al ambiente del intestino medio y a la pared del estómago y finalmente llegan a las glándulas salivales para su transmisión a un nuevo huésped vertebrado (Hardy et al., 1983; Abraham & Jacobs-Lorena, 2004) (Figura 1).

Figura 1. Ciclo sexual del protozoo de la malaria aviar en el mosquito y ciclo de arbovirus en mosquitos

Fuente: Gutiérrez-López, 2018

 En este “viaje” los patógenos tienen que atravesar diferentes barreras entre el sistema digestivo y las glándulas salivales de los mosquitos que interferirán con su desarrollo, representando así una importante fuerza selectiva importante para ellos (Smith et al., 2014). Por lo tanto, para transmitirse con éxito, los patógenos transmitidos por vectores deben llegar a un vector competente para completar su ciclo de vida. La capacidad de un mosquito para transmitir un patógeno se denomina con frecuencia capacidad o competencia de vector. Aunque ambos términos se utilizan indistintamente, existen algunas diferencias entre ellos (ver CUADRO 1). 

La competencia vectorial se define, por tanto, como el potencial de una especie de mosquito (o cualquier otro vector) para transmitir un patógeno, previamente adquirido de un hospedador, a otro hospedador vertebrado. Dicho de otro modo, un insecto es un vector competente para un patógeno dado cuando es capaz de adquirir, mantener, amplificar y finalmente transmitir con éxito el patógeno a otro hospedador. Una vez ingerido las partículas viables del patógeno, sea éste un virus u otro agente, se transmiten durante la segunda alimentación de sangre a través de la saliva del mosquito infectado. En consecuencia, la presencia del patógeno en el cuerpo entero o partes del cuerpo del mosquito, incluidas las piernas, el intestino medio o la cabeza, no sería suficiente para determinar la competencia del vector. Por ello, la obtención de muestras de salivas de los mosquitos permitiría por sí misma determinar el potencial vector sobre la base de mosquitos individuales, evitando el uso de experimentos con animales (Heitmann et al., 2018) y siendo además uno de los métodos más adecuado para analizar un gran número de mosquitos en un corto período de tiempo. Sin embargo, el reducido tamaño de otros insectos vectores como flebotomos o Culicoides dificulta obtenerdificulta la obtener saliva con éxito y los análisis suelen incluir el cuerpo entero o estructuras relativamente voluminosas. Aunque, de nuevo, lo idóneo es realizar una prueba de partículas de virus infecciosos dentro de la saliva liberada, mediante la realización de plaqueo para mirar unidades formadoras de placas (PFU en inglés), o dosis letal 50.

Una vez obtenida y analizada la muestra, para evaluar la competencia del vector se deben determinar 2 tasas:

1. La tasa de infección (IR, por sus siglas en inglés): número de cuerpos de mosquitos positivos para el patógeno por número de mosquitos alimentados.
2. La tasa de transmisión (TR, por sus siglas en inglés): número de mosquitos que presentan patógenos en saliva entre el número mosquitos que presentaron infección por el patógeno.

La tasa de infección de los mosquitos se evalúa analizando la presencia de partículas virales. Para ello se tritura el cuerpo del mosquito (homogeneizar), para después confirmar la presencia del patógeno en cuestión mediante la reacción en cadena en tiempo real de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR), o una PCR estándar dependiendo del patógeno.

Para el cálculo de las tasas de transmisión se analiza la presencia de partículas virales viables en la saliva de mosquitos individuales. Esto se puede lograr mediante dos métodos, i) la alimentación de mosquitos infectados en animales huéspedes susceptibles, seguido del análisis de la viremia en el huésped (Turell et al., 2008), pero este método se basa en el uso modelos animales adecuados y es costoso, estando además restringido por las normas de bienestar animal, o ii) mediante la obtención de muestras de salivas y posteriormente poner en contacto estas muestras de saliva con células in vitro y estudiar el efecto citopático que presentan las muestras de saliva sobre estas células formando calvas de lisis o unidades formadoras de placas (PFU). Igualmente, al igual que como se hace con la tasa de infección, para la tasa de transmisión también se confirmar la presencia del patógeno en cuestión mediante la reacción en cadena en tiempo real de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR), o una PCR estándar dependiendo del patógeno.

Respecto a la técnica para la obtención de saliva a escala individual, la primera descripción del método se publicó en 1966 (Hurlbut, 1966) y ha sido en los últimos años cuando la obtención de muestras de saliva se ha convertido en el método de elección para evaluar la competencia vectorial de los mosquitos (Figura 2). Sin embargo, en los experimentos de obtención de saliva, es imposible probar directamente que se produzca la liberación de saliva. Para probar la actividad de la salivación, las muestras podrían analizarse en busca de otros componentes presentes en la saliva (p. ej., proteínas, carbohidratos, etc.). Esto, sin embargo, requiere la división de las muestras de saliva para varios análisis, lo que puede limitar la sensibilidad y podría conducir a una subestimación de las tasas de transmisión. Por lo tanto, para obtener resultados reproducibles, es necesario asegurarse de que todos los mosquitos permanezcan vivos hasta el final del experimento. Esto se controla visualmente observando la actividad de movimiento corporal de los mosquitos.

Figura 2. Obtención de saliva de un mosquito Culex pipiens.

Fuente: Fotografía de Rafael Gutiérrez López

Sin duda, la obtención de saliva tiene muchas ventajas. Se pueden analizar grandes cantidades de mosquitos simultáneamente en condiciones estandarizadas controladas sin entrar en conflicto con las normas de bienestar animal (Heitmann et al., 2017; CUADRO 2). Aunque el método es utilizado por varios laboratorios, las configuraciones exactas pueden diferir, lo que puede generar diferencias en los resultados entre laboratorios. Un componente crítico es el capilar para recolectar la saliva, que puede ser de vidrio (Weger-Lucarelli et al., 2016) o plástico (Dubrulle, et al., 2019). Para cumplir con las normas de seguridad de un insectario de nivel 3 de bioseguridad, es fundamental utilizar puntas con filtro de plástico, reduciendo el riesgo de accidentes laborales. Además, las puntas con filtro tienen la ventaja de que el líquido recogido se puede transferir con una pipeta. La obtención de saliva nos va a permitir obtener información sobre la competencia vectorial de las especies de mosquitos. Sin embargo, para responder a algunas otras preguntas específicas (por ejemplo, la cantidad de picaduras de mosquitos que se necesitan para infectar a los vertebrados), es posible que se requieran experimentos con animales.